Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing
La Next Generation Sequencing è una tecnologia di sequenziamento avanzata con la quale molteplici molecole di DNA vengono sequenziate nello stesso momento; questa tecnologia viene anche chiamata sequenziamento massivo parallelo. Le suddette brevi molecole di DNA vengono poi assemblate comparando la loro sequenza con una di riferimento, rivelando così l'intera sequenza di DNA che può essere molto lunga (tanto quanto il nostro genoma).
Ci sono molte piattaforme diverse che eseguono la Next Generation Sequencing e ognuna di esse utilizza una tecnica diversa per ottenere il sequenziamento del DNA. In questo caso, ci soffermeremo sulla tecnologia di terminatori reversibili impiegata da Illumina. Con questo metodo, il DNA viene prima frammentato in dimensioni più piccole e due molecole brevi di DNA chiamate "Adattatori" vengono ligate ad ogni estremità del campione (vedi Figura 2). Questi adattatori funzioneranno come siti di aggancio del primer per amplificare il DNA durante la PCR e legarlo alla cella di flusso. Prima di analizzare i dati, gli adattatori vengono rimossi in quanto non sono sequenze biologiche.
Le molecole di DNA marcate con gli adattatori e i primer vengono prima fissate a una piastra (chiamata cella di flusso) e amplificate con l'enzima della polimerasi creando colonie locali di DNA clonato. Queste colonie di DNA vengono anche dette DNA cluster. Ognuno di questi cluster contiene la stessa sequenza di DNA, da cui il termine colonie di DNA clonato. Similmente alla tecnica utilizzata nel sequenziamento di prima generazione, i nucleotidi vengono etichettati individualmente con una tinta fluorescente. Dopo l'aggiunta di un nucleotide, l'elongazione si ferma e viene scattata una foto. In seguito, il bloccante presente all'estremità 3' viene rimosso chimicamente dal DNA, consentendo l'inizio del ciclo successivo di aggiunta di nucleotidi.
Una volta estratto, il DNA deve essere elaborato e preparato per il sequenziamento. I passaggi della preparazione del campione sono riportati di seguito:
- Frammentazione
- Riparazione delle estremità
- Adenilazione
- Ligazione degli adattatori
- Amplificazione tramite PCR
Questi passaggi sono seguiti dalla generazione dei cluster e dal processo di sequenziamento.
Figura 1. Procedura di svolgimento della Next Generation Sequencing utilizzando la tecnologia Illumina.
Il sequenziamento in parallelo produce miliardi di letture ad ogni esecuzione. Questo risultato è esponenzialmente maggiore delle letture fornite dal sequenziamento di prima generazione. La Next Generation Sequencing è un'ottima tecnica utile per diverse applicazioni, come la profilazione del SNP, l'analisi dell'espressione genica e il rilevamento delle aberrazioni genetiche come mutazioni e riarrangiamenti cromosomici.
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