Preparazione del NGS
In modo simile alla tecnica di sequenziamento di prima generazione, nel processo di sequenziamento Illumina basato sul sequenziamento per sintesi i nucleotidi sono contrassegnati individualmente con un colorante fluorescente.
- Viene aggiunto un nucleotide fluorescente, complementare alla sequenza di DNA da identificare, e l'allungamento si interrompe a causa di un bloccante sulla sua estremità 3'.
- Viene scattata una foto per registrare il colorante/nucleotide.
- Il bloccante situato sull'estremità 3' che ha fermato l'allungamento viene rimosso chimicamente dal DNA, consentendo la successiva aggiunta di nucleotidi.
La differenza col sequenziamento di prima generazione è che il sequenziamento parallelo produce milioni di letture per volta; ciò lo rende quindi un metodo molto più efficiente.
Per eseguire un esperimento NGS basato sul sequenziamento tramite sintesi sono necessari:
- Campione di DNA modificato con adattatori
- Nucleotidi modificati
- Polimerasi T4
- Macchinario per Next Generation Sequencing
- Generazione di cluster