Esperimento Next Generation Sequencing

Dopo la generazione del cluster, siamo pronti per iniziare il processo di sequenziamento. Esistono diverse piattaforme di Next Generation Sequencing e ognuna di esse utilizza una tecnica diversa per effettuare il sequenziamento del DNA. In questo caso, ci concentreremo sulla tecnologia di colorazione dell'estremità reversibile impiegata da Illumina: sequenziamento tramite sintesi. Ciò implica che i dati di sequenziamento vengano ottenuti sintetizzando ciascuna coppia di basi. Esaminiamo il processo in dettaglio.

Adesione della polimerasi

Una volta che il cluster di DNA clonale aderisce alla cella di flusso, i reagenti di sequenziamento vengono pompati al suo interno. Entrano da un lato della cella di flusso ed escono dall'altro lato. La DNA polimerasi T4 viene immessa e aderisce alle corte molecole di DNA legate alla cella di flusso.

Tutti e 4 i nucleotidi sono marcati con un fluoroforo specifico. Nell'esempio in Figura 1, la timina è segnata con un fluoroforo verde, la citosina con un fluoroforo blu, la guanina con un fluoroforo rosso e l'adenina con un fluoroforo arancione.

Anche questi nucleotidi sono modificati: hanno un cappuccio in posizione 3' che consente l'aggiunta di un solo nucleotide alla volta. Pertanto, dopo che un nucleotide è stato aggiunto all'estremità 3' del primer, altri nucleotidi non possono più attaccarsi. Eventuali nucleotidi liberi vengono quindi lavati via dal sistema.

Figura 1: Sequenziamento tramite sintesi. Dopo che la polimerasi si è attaccata al primer, i nucleotidi segnati con un fluoroforo specifico verranno aggiunti all'estremità 3' del primer. I nucleotidi vengono modificati con un cappuccio in posizione 3' che consente l'aggiunta di un solo nucleotide alla volta. Viene rilevato il segnale fluorescente emesso dal fluoroforo e il cappuccio in posizione 3' viene tagliato consentendo l'inizio del ciclo di sequenziamento successivo.

Nucleotidi segnati con fluoroforo

Rilevamento

Poiché tutti i nucleotidi sono segnati individualmente con uno specifico fluoroforo, possiamo identificare i nucleotidi osservando il segnale di fluorescenza che essi emettono. Ad esempio, in Figura 1 possiamo osservare che un nucleotide marcato con un fluoroforo verde è stato aggiunto all'estremità 3' del primer. Una reazione chimica innesca l'emissione della luce verde che può essere registrata scattando una foto. Poiché sappiamo che la timina è etichettata con il fluoroforo verde, possiamo identificare la base come timina. Alla fine di ogni ciclo vengono scattate quattro fotog, le quali registrano ciascuno dei possibili colori. Dopo aver scattato tutte e quattro le foto, il sistema le sovrapporrà. Pertanto, possiamo facilmente identificare l'identità di base di ciascun cluster (vedi Figura 2).

Figura 2: Un'immagine sovrapposta, ogni punto colorato rappresenta un cluster di DNA amplificato clonalmente. I codici colore per i quattro diversi nucleotidi: timina, citosina, guanina e adenina.

Clivaggio e rimozione

Dopo che la foto è stata scattata, il cappuccio in posizione 3' del nucleotide viene staccato in modo che possa iniziare il successivo ciclo di sequenziamento. Questo segna la fine di un ciclo di sequenziamento e il nuovo ciclo può iniziare con l'inserimento di nuovi nucleotidi fluorescenti e la ripetizione di ogni passaggio.

Dopo il sequenziamento, le immagini vengono inserite in un computer e i dati di sequenziamento possono essere analizzati con un software specifico.