Tecnica del patch clamp

La tecnica del patch clamp è una tecnica versatile usata in elettrofisiologia per studiare i canali ionici in cellule vive isolate, sezioni di tessuto o patch di una membrana cellulare. "Patch" indica un piccolo pezzo della membrana cellulare e "clamp" si riferisce al "bloccare" una delle variabili elettriche (tensione o corrente) mentre si misura l'altra. A seconda della variabile "bloccata", la tecnica è più specificamente chiamata metodo del voltage clamp o metodo del current clamp. Queste tecniche sono particolarmente utili nello studio delle cellule eccitabili come i neuroni.

Gli elementi comuni utilizzati in questa tecnica sono:

• Tampone di perfusione in cui le cellule possono sopravvivere (per esempio CsCl/MgCl₂)

• Un circuito elettrico composto da:

  • Punta della pipetta con un elettrodo di registrazione (normalmente in contatto con la cellula)

  • Elettrodo di terra di riferimento (normalmente in contatto con il tampone di perfusione)

  • Cellule di interesse tra gli elettrodi

• Micromanipolatore per controllare gli elettrodi

• Diversi hardware e software per amplificare e registrare i segnali

Figura 1: Rappresentazione schematica di alcuni componenti della tecnica del patch clamp

Dopo aver aggiunto il tampone di perfusione alle cellule, la punta della pipetta con l'elettrodo di registrazione entra in contatto con una piccola area della membrana cellulare. Poi, a seconda dell'obiettivo dell'esperimento, ci sono diverse varianti della tecnica, indipendentemente dalla variabile "bloccata":

• Configurazione cell attached: la membrana cellulare non viene interrotta. Questa tecnica registra la tensione o la corrente attraverso un singolo canale ionico e si usa per confrontare le caratteristiche di risposta di diversi canali.

• Configurazione whole cell: la membrana cellulare è interrotta e l'interno della punta con l'elettrodo di registrazione diventa continuo con il citoplasma cellulare. Questa tecnica registra la tensione o la corrente dell'intera cellula.

• Configurazione inside-out: la membrana cellulare è interrotta, ma la parte della membrana cellulare con il canale ionico all'interno della punta della pipetta rimane attaccata e vitale. Questa tecnica viene usata per registrare la risposta della parte intracellulare di singoli canali a diverse sostanze.

• Configurazione outside-out: la membrana cellulare è interrotta e la zona della membrana cellulare con un canale ionico che rimane attivo e vitale è all'esterno della punta della pipetta. Quando la membrana cellulare viene riparata, la parte extracellulare del canale è esposta alle sostanze di interesse. Questa tecnica viene usata per studiare come i segnali chimici extracellulari influenzano l'attività del canale ionico.