Esperimento PCR

Per preparare miliardi di copie di DNA, vengono eseguiti molti cicli ripetuti di sintesi del DNA in una provetta PCR. Ogni ciclo comprende tre fasi distinte definite dalla temperatura (vedi figura sotto):

1. Fase di denaturazione (95ºC): a questa alta temperatura, i legami idrogeno che tengono insieme i due filamenti di DNA si rompono e i filamenti di DNA si separano. Lo stampo di DNA a singolo filamento è ora disponibile per la copiatura.
2. Fase di appaiamento (5-10ºC al di sotto di quella del primer con la Tm più bassa): alla temperatura di appaiamento, brevi frammenti di DNA chiamati primer si legano ai siti complementari del DNA stampo. I primer definiscono la sequenza target, cioè la regione specifica di DNA che sarà copiata. La temperatura di appaiamento è calcolata in base alla composizione del primer (il numero di nucleotidi e il numero di guanine e citosine). Di solito è necessario calcolare la temperatura di appaiamento ottimale per ogni primer.
3. Fase di estensione (72ºC): a 72ºC, un enzima chiamato DNA polimerasi effettua la copia del DNA. Riconosce l'estremità 3′ di un primer legato a un filamento stampo e inizia a copiare il DNA stampo. In questo caso si tratta di una polimerasi termostabile perché deve essere attiva alle elevate temperature che caratterizzano questa fase.

Tutti i cicli vengono eseguiti senza intervento attivo in una macchina per PCR, che può cambiare la temperatura automaticamente dopo ogni passaggio. Alla fine di un ciclo, il numero di frammenti dei filamenti iniziali di DNA è raddoppiato. Ad esempio, alla fine di 30 cicli (solitamente eseguiti durante la PCR), nella provetta sarà presente almeno 1 miliardo (2³⁰) di copie della sequenza target.

Esperimento PCR: la PCR si compone di tre fasi 1) denaturazione; 2) appaiamento; 3) estensione. Le fasi sono ripetute molte volte (generalmente 30) e permettono di ottenere miliardi di copie di DNA di regioni specifiche.