Preparazione PCR
Per eseguire un esperimento PCR si ha bisogno di:
- Primer
- Nucleotidi
- DNA polimerasi
- Modello del DNA
- Attenzione particolare alle contaminazioni
- Un termociclatore
Se uno di questi componenti manca, non si verificherà alcuna reazione e non verrà sintetizzato il DNA.
Le miscele master contengono la maggior parte dei componenti della PCR (eccetto il modello DNA) in una quantità maggiore, relativa alla quantità di reazioni PCR che vorremmo fare. Puoi ridurre l'errore sperimentale e la variabilità e risparmiare tempo preparando le miscele master.
Di solito contengono i primer forward e reverse specifici, i nucleotidi (dNTPs), l'enzima Taq polimerasi, e opzionalmente MgCl2, acqua priva di nucleasi e un tampone di reazione.
Primer: i primer si legano a una specifica sequenza di DNA e segnano l'inizio dell'amplificazione del DNA. Il design dei primer è molto importante per amplificare con successo la regione di interesse. Essi definiscono la lunghezza del prodotto della PCR limitandone i lati.
Nucleotidi: i nucleotidi sono necessari per costruire la nuova sequenza di DNA, sono i mattoni del DNA.
Polimerasi: la polimerasi è l'enzima che assembla i nucleotidi in base alla sequenza del modello. Taq polimerasi è la più comune DNA polimerasi utilizzata negli esperimenti di PCR.
Modello del DNA: è necessario un modello di base di una nuova amplificazione della sequenza di DNA. Eseguire l'isolamento del DNA per estrarre il DNA dalle cellule.
Attenzione particolare alle contaminazioni: quando ti prepari per un esperimento di PCR, devi stare molto attento alle potenziali contaminazioni. La PCR è una tecnica molto potente per amplificare il DNA. Questo significa che se hai una piccola contaminazione (per esempio, DNA proveniente da altri campioni), anche questo DNA può essere amplificato, entrando in competizione con il modello originale e distruggendo i risultati del tuo esperimento. Per prevenire la contaminazione, devi sempre usare i guanti e lavorare in un ambiente molto pulito (per esempio, cambia i puntali delle pipette quando stai pipettando da un altro contenitore, legati i capelli o non tossire o starnutire intorno al banco di lavoro della PCR).