Amplificazione PCR

La PCR è un metodo usato per preparare miliardi di copie di specifiche sequenze di DNA.

Spesso è necessario avere un numero di copie della sequenza di DNA specifico maggiore di quello che si trova in un campione tipico, usato per analizzarne la sequenza di basi o la lunghezza. Inoltre, la reazione PCR è altamente specifica, il che significa che produrrà solo copie di una sequenza desiderata del modello (campione) di DNA. Questa specificità è garantita dai primer, che sono progettati per essere complementari e per appaiarsi a regioni specifiche su ogni lato della regione di DNA di interesse (regione bersaglio). Queste caratteristiche rendono la PCR una tecnica potente da utilizzare, per esempio, nella genotipizzazione dei marcatori, prima del sequenziamento, o in vari test del DNA.

Figura 1. La PCR si compone di tre fasi: 1. Denaturazione, 2. Annealing e 3. Allungamento. Le fasi vengono ripetute molte volte (spesso 30), producendo miliardi di copie di DNA di regioni specifiche

Fasi della PCR

Per preparare miliardi di copie di DNA, vengono eseguiti in una provetta PCR molti cicli ripetuti di sintesi del DNA. Ogni ciclo include tre fasi distinte definite dalla temperatura (Figura 1). Tutti i cicli vengono eseguiti senza intervento, in una macchina PCR, che può cambiare la temperatura automaticamente dopo ogni passaggio.

1. Fase di denaturazione (95 ºC): a questa alta temperatura, i legami di idrogeno che tengono insieme i due filamenti di DNA si rompono, e i filamenti di DNA si separano. Il DNA a singolo filamento è ora disponibile per la copiatura.
2. Fase di annealing (5-10ºC sotto il primer con la Tm più bassa): alla temperatura di annealing, brevi pezzi di DNA chiamati primer si legano ai siti complementari del DNA modello. I primer definiscono la sequenza target, cioè la regione specifica di DNA che sarà copiata. La temperatura di annealing è calcolata dalla composizione del primer (il numero di nucleotidi e il numero di guanina e citosina). Normalmente, è necessario calcolare la temperatura di annealing ottimale per ogni primer. In questo caso, consideriamo 54°C come temperatura di annealing per tutti i primer.
3. Fase di estensione (72ºC): A 72 ºC, un enzima chiamato DNA polimerasi è responsabile della copia del DNA. Riconosce l'estremità 3′ di un primer legato a un filamento modello e inizia a copiare il DNA modello. In questo caso si tratta di una polimerasi termostabile perché ha bisogno di essere attiva alle alte temperature utilizzate.

Alla fine di un ciclo, parti dei filamenti di DNA iniziali sono raddoppiati. Alla fine, ad esempio, di 30 cicli, che è il numero di solito eseguito quando si fa la PCR, almeno 1 miliardo (2³⁰) di copie della sequenza target sarà presente nella provetta.

Reagenti PCR

Sono necessari diversi reagenti per eseguire un esperimento di PCR:

• Primer: i primer si legano ad una specifica sequenza di DNA e segnano l'inizio dell'amplificazione del DNA.
• Nucleotidi: i nucleotidi sono necessari per costruire la nuova sequenza di DNA.
• Polimerasi: la polimerasi è un enzima che assembla i nucleotidi sulla base della sequenza del modello.
• DNA modello: un modello è necessario per rappresentare la base della nuova amplificazione della sequenza di DNA.

Quando ti prepari per un esperimento di PCR, è necessario stare molto attenti alla potenziale contaminazione. La PCR è una tecnica molto potente per amplificare il DNA. Questo significa che se accade una piccola contaminazione (per esempio, DNA proveniente da altri campioni), anche questo DNA può essere amplificato, entrando in competizione con il modello originale e distruggendo i risultati del tuo esperimento. Per prevenire la contaminazione, devi sempre usare i guanti e lavorare in un ambiente molto pulito (per esempio, cambia i puntali delle pipette quando stai pipettando da un contenitore diverso, lega i capelli e non tossire o starnutire vicino al banco di lavoro della PCR).

Come descritto sopra, un errore nella PCR può facilmente alterare il risultato. Questo è il motivo per cui dobbiamo ridurre al minimo la probabilità di errore della PCR, specialmente quando stiamo procedendo con un'altra tecnica estremamente sensibile come il Next Generation Sequencing (NGS). Tipicamente la fase della PCR nel NGS consiste solo di 10-12 cicli. L'errore che viene creato nella fase PCR verrà visualizzato come mancata corrispondenza nell'allineamento dei dati NGS, in particolare si tratta di errori nei primi cicli di PCR che verranno visualizzati in più letture, suggerendo erroneamente una variazione genetica del campione.