PCR
La PCR è un metodo utilizzato per preparare miliardi di copie di specifiche sequenze di DNA. Spesso è necessario disporre di un numero maggiore di copie di una sequenza specifica del DNA rispetto a quello trovato in un campione tipico, per analizzare la sequenza o lunghezza della coppia di basi del DNA. Inoltre, la reazione PCR è altamente specifica, il che significa che produrrà solo copie di una sequenza desiderata del DNA stampo (campione). La sua specificità è assicurata dai primer, che sono progettati per essere complementari a regioni specifiche su ciascun lato della regione del DNA di interesse (regione bersaglio) con il processo di annealing. Queste caratteristiche rendono la PCR una tecnica potente da utilizzare, ad esempio, nella genotipizzazione dei marcatori, prima del sequenziamento, o in vari test del DNA.
Figura 1. La PCR è composta da 3 fasi: 1. Denaturazione, 2. Appaiamento e 3. Estensione. I passaggi vengono ripetuti molte volte (spesso 30), producendo miliardi di copie di DNA di regioni specifiche.
Fasi della PCR
Per preparare miliardi di copie di DNA, vengono eseguiti molti cicli ripetuti di sintesi del DNA in una provetta per PCR. Ogni ciclo comprende tre fasi distinte definite dalla temperatura (Figura 1). Tutti i cicli vengono eseguiti senza intervento in una macchina PCR, che può modificare automaticamente la temperatura per creare i passaggi.
- Fase di denaturazione (95ºC): a questa temperatura elevata, i legami idrogeno che tengono insieme i due filamenti di DNA si rompono e i filamenti di DNA si disgregano. Il DNA a singolo filamento è ora disponibile per la copia.
- Fase di appaiamento (54ºC): a 54°C, brevi frammenti di DNA chiamati primer si legano ai siti complementari del DNA stampo. I primer definiscono la sequenza bersaglio, che è la regione specifica del DNA che verrà copiata. La temperatura di ricottura è calcolata dalla composizione del primer (il numero di nucleotidi e il numero di guanina e citosina). Normalmente, si dovrebbe calcolare la temperatura di appaiamento ottimale per ciascun primer. In questo caso, consideriamo 54°C come temperatura di appaiamento per tutti i primer.
- Fase di estensione (72ºC): a 72ºC, un enzima chiamato DNA polimerasi è responsabile della copia del DNA. Riconosce l'estremità 3' di un primer legato a un filamento stampo e inizia a copiare il DNA stampo.
Alla fine di un ciclo, parti dei filamenti iniziali di DNA sono stati raddoppiato di numero. Alla fine di, ad esempio, 30 cicli, solitamente eseguiti in PCR, nella provetta sarà presente almeno 1 miliardo (230) di copie della sequenza target. Per eseguire la PCR, è necessario aggiungere una DNA polimerasi termostabile, nucleotidi, primer e DNA che si desidera utilizzare come modello.
Reagenti PCR
Sono necessari diversi reagenti per eseguire un esperimento di PCR:
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Primer: i primer si legheranno a una specifica sequenza di DNA e segneranno l'inizio dell'amplificazione del DNA
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Nucleotidi: i nucleotidi sono necessari per costruire la nuova sequenza di DNA
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Polimerasi: la polimerasi è un enzima che assembla i nucleotidi sulla base della sequenza stampo
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DNA modello: un modello è necessario per essere la base della nuova amplificazione della sequenza di DNA
Quando ci si prepara per un esperimento di PCR, è necessario prestare particolare attenzione per evitare potenziali contaminazioni. La PCR è una tecnica molto potente per amplificare il DNA. Ciò significa che se hai una piccola contaminazione (ad esempio, DNA proveniente da un altro campione), anche questo DNA può essere amplificato, competendo con il modello originale e falsificando i risultati. Per prevenire la contaminazione, è necessario utilizzare sempre i guanti e lavorare in un ambiente molto pulito (cambiare i puntali della pipetta quando si pipetta da un contenitore diverso, legarsi i capelli, non tossire o starnutire intorno al banco di lavoro della PCR e altro).