Il metodo fenolo-cloroformio per l'isolamento degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici delle cellule possono essere isolati usando il metodo fenolo-cloroformio. Il fenolo-cloroformio è una miscela di fenolo saturo e cloroformio in rapporto 1:1. I passaggi della procedura sono i seguenti:

1. Lisi e omogeneizzazione in soluzione acquosa. Vengono effettuate con un tampone di lisi e agitando il campione.
2. Aggiunta del fenolo-cloroformio al lisato e agitazione tramite miscelatore vortex.
3. Centrifugazione per separare le fasi in base alla densità. Il fenolo ha una densità di 1,07 g/cm³ mentre il cloroformio ha una densità maggiore (1,47 g/cm³), quindi formano due fasi: la fase organica inferiore (fenolo-cloroformio) e la fase acquosa superiore (vedi immagine sotto). Gli acidi nucleici guadagnano polarità dalla struttura fosfato con carica negativa; quindi, gli acidi nucleici sono solubili nella fase acquosa superiore. Le proteine contengono regioni idrofobiche che interagiscono con il fenolo e fanno precipitare le proteine nell'interfaccia tra le due fasi (spesso sotto forma di flocculato bianco). Anche i lipidi hanno una regione idrofoba e si disciolgono nella fase organica inferiore. Il pH della miscela determina la separazione degli acidi nucleici. A pH neutro, RNA e DNA sono trattenuti nella fase acquosa superiore; tuttavia, a pH acido, il DNA si sposta nella fase organica inferiore e l'RNA rimane nella fase acquosa superiore.
4. Recupero dell'acido nucleico. Nell'ultima fase, gli acidi nucleici vengono recuperati dalla fase acquosa mediante precipitazione con isopropanolo.

Il metodo di estrazione fenolo-cloroformio è usato per l'isolamento degli acidi nucleici.