Minipreparazioni di plasmidi
Ci sono diversi metodi per purificare il DNA plasmidico dalle cellule batteriche. La Miniprep è un metodo di isolamento rapido e su piccola scala, che si basa sulla lisi alcalina delle cellule, seguita dalla purificazione su colonna di silice del DNA.
Per purificare i plasmidi da una coltura batterica bisogna eseguire i seguenti passaggi:
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Pellettatura delle cellule mediante centrifugazione a 10K rpm per 3 minuti.
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Omogeneizzazione delle cellule aggiungendo un tampone di omogeneizzazione e pipettando ripetutamente.
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Lisare le cellule con un tampone di lisi (contenente un detergente) e invertendo ripetutamente la provetta.
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Lisare le cellule per un massimo di 5 minuti a temperatura ambiente.
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Fermare la reazione aggiungendo un tampone di neutralizzazione e capovolgendo nuovamente la provetta più volte. Appaiono dei grumi bianchi, che sono i detriti delle cellule.
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Pellettare i detriti mediante centrifugazione per 10 minuti a 13K rpm. Alla fine, il plasmide sarà nel surnatante (la fase liquida).
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Applicare il surnatante alla colonna di silice e centrifugare a 13K per 1 min. Il plasmide si legherà al filtro sul fondo della colonna. Scartare la colonnina.
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Lavare il DNA due volte con un tampone di lavaggio (aggiungere, centrifugare, scartare).
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Centrifugare 1 minuto senza aggiungere nulla, al fine di sbarazzarsi di qualsiasi buffer residuo.
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Trasferire la colonna in una provetta pulita da 1,5 ml e aggiungere il tampone di eluizione (acqua con 10mM Tris_HCl). Lasciarla sul banco per un paio di minuti prima di centrifugare di nuovo.
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Controllare le concentrazioni di DNA nel nanodrop.