Vettore posizione
I vettori posizione sono vettori di destinazione specializzati che possono essere utilizzati per l'assemblaggio Gibson di circuiti biologici di grandi dimensioni. Ogni vettore di posizione contiene una sequenza isolante della cromatina, una cassetta di ricombinazione Gateway e una sequenza di poliadenilazione.
Questi motivi di DNA sono affiancati da due sequenze differenti di nucleotidi lunghe 40 coppie di base (UNS). Le UNS sono affiancate a turno da due siti di restrizione I-SceI. Questa disposizione dei motivi di DNA consente un rapido e riproducibile assemblaggio di circuiti biologici di grandi dimensioni.
I vettori di ingresso con parti di circuito possono essere assemblati nel vettore posizione utilizzando la tecnica della clonazione gateway. La digestione SceI del plasmide risultante produrrà un frammento con le parti del circuito e i motivi di DNA affiancati dalle due UNS menzionati in precedenza. Questi frammenti possono essere subito utilizzati per l'assemblaggio Gibson. L'unicità degli UNS assicura un assemblaggio specifico di un ampio numero di frammenti differenti.
Per assemblare un circuito di grandi dimensioni dai vettori posizione è necessario svolgere i seguenti passaggi:
-
Produrre vettori di ingresso per tutte la parti del circuito
-
Clonazione Gateway delle parti del circuito nel vettore posizione
-
digestione SceI
-
Assemblaggio Gibson delle UNS complementari