Test di troncamento delle proteine
Figura 1. Un diagramma schematico che mostra le diverse fasi del test di troncamento delle proteine. 
Un test di troncamento della proteina è un metodo potente per valutare le mutazioni del DNA che provocano il troncamento della proteina in vitro. In base all'impatto sulle proteine tradotte, le mutazioni del DNA sono classificate in mutazione frame-shift, mutazione nonsenso, mutazione missenso (non sinonima), mutazione neutra e mutazione silenziosa. La mutazione nonsenso si traduce in un codone di stop prematuro. Questo significa che la proteina risultante sarà terminata prima di quello che dovrebbe e può essere rilevata utilizzando un test di troncamento della proteina. Questa proteina più corta è chiamata anche proteina troncata. Con un test di troncamento della proteina non abbiamo bisogno di usare un animale come sistema modello per sintetizzare la proteina; invece, abbiamo un sistema in vitro dove la proteina risultante può essere sintetizzata senza il requisito di cellule viventi.
I test di troncamento delle proteine sono spesso utilizzati per analizzare le mutazioni legate alla malattia, per esempio nel cancro, dove la mutazione risulta in una proteina non funzionale. Dai test di troncamento della proteina, possiamo dedurre se esiste una mutazione in una particolare parte del gene che provoca il troncamento della proteina; tuttavia, non abbiamo informazioni su dove si trova esattamente la mutazione e qual è la sequenza di DNA risultante (per esempio, potrebbe essere una sostituzione che crea un codone di stop o una delezione che provoca una mutazione frame-shift e poi un codone di stop, o altro). Per trovare maggiori informazioni sulla mutazione, abbiamo bisogno di eseguire il sequenziamento del DNA come metodo di convalida. Con il sequenziamento del DNA, saremo in grado di conoscere l'esatta sequenza di DNA che risulta in una proteina troncata.
Il test di troncamento delle proteine è composto da quattro fasi principali (Figura 1):
- Isolamento dell'acido nucleico: DNA genomico, RNA totale o poli-A RNA.
- Amplificazione di una regione specifica del gene di interesse tramite PCR. In questa fase, un codone iniziale (ATG) viene aggiunto all'estremità 5' del DNA amplificato.
- Trascrizione e traduzione in vitro del prodotto.
- Rilevamento della proteina tradotta mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Elettroforesi su gel di poliacrilammide
L'elettroforesi su gel di poliacrilammide è una tecnica usata per analizzare proteine sulla base delle loro dimensioni. È abbastanza simile all’elettroforesi su gel di agarosio utilizzata per analizzare il DNA dopo aver eseguito una PCR. A differenza del DNA, le proteine possono essere ripiegate in complesse strutture 3D. Prima di farle scorrere sul gel, dobbiamo denaturare la struttura 3D delle proteine e renderle lineari. Possiamo farlo aggiungendo sodio dodecil solfato (SDS), che è un detergente che libera le proteine per renderle lineari. L'SDS è anche necessario per caricare negativamente le proteine.
Quando le proteine sono linearizzate e hanno una carica negativa, possiamo caricarle su un gel di poliacrilammide e applicare una carica elettrica. Le proteine caricate negativamente viaggeranno attraverso la poliacrilammide porosa verso il polo positivo, che si trova alla fine del gel. Le proteine più lunghe viaggeranno più lentamente di quelle più corte; è così che possiamo separare le proteine in base alla loro lunghezza usando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide. Nel test di troncatura delle proteine, le proteine wild-type migreranno meno delle proteine troncate, che sono più corte.