Reagenti impiegati nella colorazione di Gram

Per la colorazione di Gram sono necessari quattro reagenti.

1. Il cristalvioletto (violetto di metile, CV) è la colorazione primaria utilizzata per colorare di viola i batteri sia Gram-positivi che Gram-negativi.
Le molecole del violetto di genziana sono caricate positivamente e si legano alle strutture della parete cellulare batterica caricate negativamente.

2. Lo iodio (I) agisce come fissativo del colorante (mordente) che fissa la colorazione viola sia nei batteri Gram-positivi che in quelli Gram-negativi. Le molecole di iodio si legano alle molecole di violetto tramite forze elettrostatiche per formare un grande complesso insolubile cristalvioletto-iodio (CV-I).

3. L'alcol etilico al 95% (etanolo) viene utilizzato per decolorare i batteri Gram-negativi. L'alcol dissolve la membrana esterna e distrugge il peptidoglicano sottile, consentendo ai complessi CV-I viola di sfuggire alla parete cellulare Gram-negativa. I batteri Gram-positivi trattengono la colorazione viola anche dopo il lavaggio con alcol, poiché il loro peptidoglicano è sufficientemente denso e robusto da resistere all'alcol e trattenere i complessi CV-I.

4. La safranina è usata come colorante di contrasto per colorare di rosa i batteri Gram-negativi. Al pari del cristalvioletto, è una molecola carica positivamente che si lega alle strutture della parete cellulare batterica negativa. I batteri Gram-positivi sono già colorati di viola dal cristalvioletto più scuro e rimangono viola nonostante l'aggiunta della safranina rosa.

Figura 1. Panoramica sul metodo della colorazione di Gram