Geni di riferimento

Chiamati anche geni housekeeping, i geni di riferimento sono di solito geni essenziali per la cellula perché sono necessari per le funzioni cellulari di base. I geni di riferimento dovrebbero essere espressi a livelli relativamente costanti nella maggior parte delle cellule di un organismo in condizioni normali e malate.

Le differenze nel livello di espressione dell'RNA tra due campioni possono essere il risultato sia di una vera variazione biologica che di una variazione tecnica. È molto importante ridurre al minimo la variazione tecnica sottoponendo i geni di riferimento provati in modo stabile a una adeguata normalizzazione. Questa procedura permetterà una migliore valutazione della vera variazione biologica. I geni di riferimento sono usati per la normalizzazione dei dati qPCR. Molti fattori possono infatti contribuire alla variabilità nell'analisi dei campioni, ma di solito essa è legata all'efficienza della trascrizione inversa per ogni campione. Più contaminanti rimangono nel campione di RNA, meno efficiente è la reazione di trascrizione inversa, e questo effetto varia tra i campioni.

I geni di riferimento possono variare a seconda delle condizioni sperimentali, quindi bisogna sempre testarne diversi e valutare quali sono i più stabili con le configurazioni sperimentali in uso. Tipici geni di riferimento sono GAPDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi) e ACTB (il gene che codifica la beta-actina). Ci sono diversi programmi che possono testare la stabilità dei potenziali geni di riferimento (per esempio GeNorm e NormFinder). Questi programmi possono essere usati per scegliere i migliori 2-3 geni di riferimento per il progetto a cui si sta lavorando.