PCR di trascrizione inversa

Non tutti i geni sono espressi costantemente in ogni cellula. Per produrre una specifica proteina codificata, la cellula deve trascrivere la relativa sequenza di DNA in mRNA. Pertanto, il livello di espressione genica corrisponde al livello di mRNA. L'espressione genica può essere misurata utilizzando una reazione a catena della polimerasi inversa (RT-PCR). La RT-PCR si articola nei seguenti passaggi:

• Conversione di RNA in cDNA mediante trascrittasi inversa

• Amplificazione del cDNA tramite PCR

Figura 1. Passaggi per creare cDNA da uno stampo di mRNA. Utilizzando un primer oligo(dT) viene eseguita la trascrizione inversa dell'mRNA in cDNA, seguita dall'idrolizzazione del filamento di RNA.

L'mRNA è più fragile del DNA e non può essere amplificato mediante PCR. Per questo motivo, l'mRNA viene convertito in DNA complementare (cDNA). Il cDNA altro non è che DNA sintetizzato da molecole di RNA messaggero. La sintesi del cDNA è catalizzata da un enzima detto trascrittasi inversa, che utilizza l'RNA come stampo per la sintesi del DNA. La trascrittasi inversa venne scoperta e isolata per la prima volta proprio da un retrovirus. Questi virus contengono un genoma a RNA; perciò devono produrre una copia di cDNA del loro genoma per risultare compatibili con le strutture molecolari della cellula ospite.

La reazione RT-PCR si compone delle seguenti fasi:

• Un frammento di oligo(dT) viene utilizzato come primer per legarsi alla coda 3' di poli(A) di ciascun mRNA.

• La trascrittasi inversa utilizza l'RNA come stampo per sintetizzare i filamenti di cDNA.

• L'ibrido RNA-cDNA risultante viene separato mediante un aumento di temperatura.

• Un primer gene-specifico si combina alla sua sequenza complementare.

• La DNA polimerasi produce il filamento di DNA complementare, iniziando dal sito di legame del primer.

• I filamenti vengono separati aumentando la temperatura e il ciclo PCR viene ripetuto.

Al termine della reazione RT-PCR, se il gene di interesse è stato espresso, esisteranno miliardi di copie di questo gene. La quantità di copie del DNA può essere visualizzata mediante elettroforesi su gel.