Quantificazione degli acidi nucleici

Per l'analisi di quantificazione si raccomanda la spettrofotometria. Questa tecnica dà informazioni sulla concentrazione di acidi nucleici del campione insieme a due rapporti di qualità, 260/280 e 260/230. Per ottenere informazioni sull'integrità dell'RNA dovranno essere applicate altre tecniche.

Il rapporto 260/280 riflette la purezza del DNA e dell'RNA. A 260 nm si misurano gli acidi nucleici e a 280 le proteine. Il rapporto 260/280 raccomandato dovrebbe essere tra 1,8 e 2,1. Se il rapporto è inferiore, può indicare la presenza di proteine o altri contaminanti che assorbono a 280 nm.

Il rapporto 260/230 è usato come misura secondaria della purezza degli acidi nucleici. A 260 nm si misurano gli acidi nucleici e a 230 si misurano le sostanze chimiche rimaste nel campione dalla fase di isolamento. I valori 260/230 dovrebbero essere nell'intervallo 2,0-2,2. Se il rapporto è più basso del previsto può indicare la presenza di contaminanti, che assorbono a 230 nm (ad esempio il fenolo).

Misurazione con spettrofotometro

La concentrazione degli acidi nucleici può essere determinata misurando la loro assorbanza con uno spettrofotometro come il Nanodrop.

L'assorbanza è misurata a 260 nm (A260), un livello a cui gli acidi nucleici assorbono in modo maggiore la luce. La quantità di luce assorbita è proporzionale alla quantità di acidi nucleici nel campione.

La relazione tra la concentrazione e l'assorbanza è descritta dalla legge di Beer-Lambert: A = c · ε · L, che può anche essere scritta come c = A / (ε · L), con

• c: la concentrazione di acido nucleico in moli.

• A: l'assorbanza in AU.

• ε: il coefficiente di estinzione molare dipendente dalla lunghezza d'onda (chiamato anche assorbibilità molare) in moli/cm.

• L: la lunghezza del percorso in cm (per NanoDrop questo valore è 10 mm).

Questa immagine raffigura il risultato di una quantificazione spettrofotometrica dell'RNA di un campione di RNA di alta qualità.