Preparazione per la RT-qPCR

Dopo che l'RNA è stato estratto dal campione e retrotrascritto in cDNA, è tutto pronto per quantificare i trascritti attraverso la RT-qPCR.

Un trascritto può essere quantificato solo in relazione a un gene di riferimento. I geni di riferimento sono solitamente dei geni fondamentali per la cellula, poiché necessari per lo svolgimento delle sue funzioni di base. È prevedibile che i geni di riferimento vengano espressi a livelli relativamente costanti nella maggior parte delle cellule di un organismo, in condizioni normali e di malattia.

Occorre scegliere un gene di riferimento e coppie di primer selezionate, specifiche per il gene oggetto di indagine e quello di riferimento.

Prima di iniziare l'esperimento qPCR è necessario produrre miscele di partenza per ciascuna coppia di primer, utilizzando esattamente la stessa concentrazione di primer e aggiungendo il reagente per qPCR.

Il reagente per qPCR contiene:

• SYBR Green, un composto che emette fluorescenza quando è legato al DNA a doppio filamento.
• DNA polimerasi, per amplificare il DNA.

Infine, mescolare i campioni di cDNA con ogni miscela di partenza e avviare l'esperimento qPCR.