Processo di sequenziamento

Ora che abbiamo una cella di flusso riempita con tanto DNA, siamo pronti per iniziare il processo di sequenziamento. Ci sono diversi modi di eseguire il next generation sequencing a seconda della piattaforma che si sta utilizzando. Uno di questi è il sequenziamento per sintesi, in cui i dati di sequenziamento sono ottenuti sintetizzando ogni coppia di basi.

Figura 1. Sequenziamento per sintesi. Dopo che la polimerasi è legata al primer, all'estremità 3' del primer vengono aggiunti nucleotidi marcati con un fluoroforo specifico. I nucleotidi sono modificati con un limite in posizione 3' che permette l'aggiunta di un solo nucleotide alla volta. Il segnale di fluorescenza emesso dal fluoroforo viene rilevato e il limite in posizione 3' viene scisso, permettendo l'inizio del prossimo ciclo di sequenziamento.

Attacco della polimerasi

Una volta che abbiamo il cluster di DNA clonale che si lega alla cella di flusso, i reagenti di sequenziamento vengono in essa pompati. Entrano da un lato della cella di flusso ed escono dall'altro lato. La DNA polimerasi T4 viene inserita e si lega alle molecole brevi di di DNA attaccate alla cella di flusso (agendo da primer di sequenziamento).

Nucleotidi marcati con fluoroforo

Ognuno dei quattro nucleotidi è marcato con un fluoroforo specifico. Per esempio, la timina è marcata con un fluoroforo verde, la citosina con un fluoroforo blu, la guanina con un fluoroforo rosso e l'adenina con un fluoroforo arancione. Questi nucleotidi sono anche modificati; hanno un limite in posizione 3' che permette solo l'aggiunta di un nucleotide alla volta. Pertanto, dopo che un nucleotide è stato aggiunto all'estremità 3' del primer, nessun altro nucleotide può attaccarsi. I nucleotidi rimanenti che galleggiano liberamente vengono poi lavati via dal sistema.

Rilevazione del fluoroforo

Dato che tutti i nucleotidi sono etichettati individualmente con uno specifico fluoroforo, possiamo identificare i nucleotidi osservando il segnale di fluorescenza che emettono. Per esempio, nella Figura 1, possiamo vedere che un nucleotide marcato con un fluoroforo verde è aggiunto all'estremità 3' del primer. Una reazione chimica innesca l'emissione della luce verde che può essere registrata scattando una foto. Poiché sappiamo che la timina è etichettata con il fluoroforo verde, possiamo identificare la base come timina. Alla fine di ogni ciclo vengono scattate quattro foto, registrando ciascuno dei colori possibili. Dopo aver scattato tutte e quattro le foto, il sistema sovrappone tutte e quattro le immagini; quindi è possibile identificare rapidamente l'identità della base di ogni cluster.

Scissione e rimozione

Dopo che l'immagine è stata scattata, il limite in posizione 3' del nucleotide viene scisso in modo che il prossimo ciclo di sequenziamento possa iniziare. Il limite viene poi rimosso dal sistema. Questo segna la fine di un ciclo di sequenziamento e il nuovo ciclo può iniziare con il lavaggio di nuovi giri di nucleotidi e ripetendo i passaggi.

Per maggiori informazioni: - Sequenziamento a singola estremità vs. a coppia