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Spettrofotometro

Lo spettrofotometro è uno strumento che fornisce informazioni sull'intensità di energia irradiata. Lo spettrofotometro è uno strumento che determina il rapporto tra l'intensità della luce emessa da una sorgente interna e quella che attraversa una data soluzione. Questo rapporto può essere utilizzato per determinare la concentrazione di molecole disciolte in un campione.

Prima di iniziare la misurazione di un campione, lo spettrofotometro viene impostato per misurare a una determinata lunghezza d'onda. La lunghezza d'onda rilevata può essere sintonizzata su un valore ottimale per misurare uno specifico composto.

Durante la misurazione, lo spettrofotometro restituisce i dati come valori di assorbanza (A). L'assorbanza è calcolata come log(I0/It), dove I0 è l'intensità della luce incidente (luce che cade su un campione) e It è l'intensità della luce che attraversa la soluzione e procede verso un rilevatore fotovoltaico.

La relazione tra assorbanza e concentrazione è lineare ed è descritta dalla legge di Beer-Lambert:

A = εcl

dove c è la concentrazione della soluzione, l è la lunghezza del percorso, altrimenti descritta come la distanza percorsa dalla luce quando passa attraverso una soluzione (tipicamente la larghezza di una cuvetta), ed ε è il coefficiente di estinzione, che è specifico per un composto.

Illustrazione dei componenti di uno spettrofotometro. Da sinistra a destra, la luce viene emessa da una sorgente luminosa, con frecce che rappresentano il modo in cui viaggia la luce. Le frecce puntano a destra, verso un collimatore, che è rappresentato come una lente di forma ovale attraversata dalla luce. Quindi le frecce puntano di nuovo verso destra e la luce viaggia attraverso un monocromatore a forma di prisma. Dal monocromatore, la luce si diffonde in un campo più ampio che mostra tutte le lunghezze d'onda rappresentate in diversi colori. La luce raggiunge un selettore di lunghezza d'onda o una fenditura e viene lasciata passare solo una specifica lunghezza d'onda, rappresentata come una linea di luce gialla. La linea gialla quindi viaggia attraverso una cuvetta a forma di cilindro riempita con una soluzione di campione. Sul lato sinistro della cuvetta c'è I 0 e sul lato destro della cuvetta c'è I t. Alla fine dello spettrofotometro è presente una fotocellula o un rilevatore che misura l'intensità della luce che passa attraverso la cuvetta e i risultati vengono visualizzati su un display digitale, noto anche come misuratore.

Figura 1: componenti di uno spettrofotometro: la luce emessa dalla sorgente attraversa una fessura, lasciando passare solo una specifica lunghezza d'onda. Questa luce attraversa parzialmente il campione posto in una cuvetta e il rivelatore misura l'intensità sull'altro lato della cuvetta.

In un esempio, misureremo le concentrazioni di NADH. NADH ha un massimo di assorbimento a 340 nm; quindi, lo spettrofotometro è impostato per misurare a questa lunghezza d'onda. Il coefficiente di estinzione per NADH è il seguente: ε = 6220 M-1cm-1. La lunghezza del percorso è la larghezza della cuvetta, che è di 1 cm.

Ci sono alcune limitazioni della legge Beer-Lambert legate a problemi tecnici che gli utenti dello spettrofotometro devono considerare. Tuttavia, il limite principale di tale legge è rappresentato dal fatto che si applica solo alle soluzioni diluite. Quando la concentrazione di una specie assorbente aumenta, aumenta anche la frequenza delle interazioni fisico-chimiche tra le molecole. Pertanto, a una data concentrazione, le molecole inizieranno a influenzare la distribuzione della carica di quelle vicine. Quando ciò si verifica, la relazione tra assorbanza e concentrazione non è più lineare. Come regola generale, durante le misurazioni si dovrebbe rimanere al di sotto di un valore di assorbimento di 1.

L'assorbanza è inversamente proporzionale alla trasmittanza (luce che passa attraverso un campione che non viene assorbita). Quando l'assorbanza = 1, il 10% della luce viene trasmessa attraverso il campione; quando l'assorbanza è pari a 2, l'1% della luce viene trasmesso, e così via con andamento logaritmico.