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Principio della spettrofotometria

Lo spettrofotometro è impostato solo per misurare a una determinata lunghezza d'onda; è possibile regolarla in modo da utilizzare la lunghezza d'onda ottimale per la misurazione del composto specifico. Lo spettrofotometro mostra la cosiddetta assorbanza (A), che è calcolata come log(It/I0), dove I0 è l'intensità della luce incidente, e It è l'intensità della luce che passa attraverso la soluzione ed è misurata dallo spettrofotometro. C'è una relazione lineare tra l'assorbanza e la concentrazione; questa relazione è descritta dalla legge di Lambert-Beer come segue:

A = log (I0 / It) = ε - c - l

dove c è la concentrazione della soluzione, l è la lunghezza della soluzione (attraverso cui la luce deve passare) ed ε è il coefficiente di estinzione molare, specifico per un composto. [1]

Uno spettrofotometro è composto da quanto segue (Fig. 1):

  • una fonte di luce

  • un selettore di lunghezza d'onda

  • un contenitore del campione (ad esempio, una cuvetta)

  • trasduttori di radiazione

  • un rivelatore

La linea retta nera va dalla sorgente di luce, rappresentata da una lampadina, verso la punta di una piramide blu, chiamata monocromatore. Da quel punto, la stessa linea retta, ora chiamata I zero, si piega per diventare orizzontale, e passa attraverso una linea spessa, nera, verticale, chiamata apertura regolabile. Dietro l'apertura, è posizionato il rettangolo allineato verticalmente chiamato cuvetta, con la soluzione verde, chiamata campione. La linea I zero passa attraverso la cuvetta con il campione, cambiando nome in I, e termina in una struttura ellittica, chiamata fotoresistore. Il fotoresistore è collegato a un altro triangolo, chiamato amplificatore, che a sua volta è collegato a un rettangolo giallo, all'interno del quale viene visualizzata l'uscita, pari a 0,260 A.

Fig. 1. La luce emessa dalla sorgente passa attraverso la fenditura, lasciando passare solo una particolare lunghezza d'onda. La luce passerà attraverso il campione posto in una cuvetta e sarà misurata dal rivelatore.

Ad esempio, misureremo le concentrazioni di NADH. Il NADH ha un massimo di assorbimento a 340 nm; quindi, lo spettrofotometro è impostato per la misurazione a tale lunghezza d'onda. Il coefficiente di estinzione per il NADH è calcolato come segue: ε =6220 M-1cm-1. La lunghezza della soluzione è solitamente impostata a 1 cm.

La legge di Beer-Lambert ha alcune limitazioni che il ricercatore deve prendere in considerazione. Alcune di queste sono legate a questioni tecniche; tuttavia, la legge ha una reale limitazione, perché si applica solo a soluzioni diluite. Quando la concentrazione di una specie assorbente aumenta, aumentano anche le interazioni fisico-chimiche tra le molecole. Così, a una data concentrazione, le molecole cominceranno a influenzare la distribuzione della carica delle molecole vicine; quando questo accade, la relazione tra assorbanza e concentrazione non è più lineare. Come regola generale, si dovrebbe rimanere al di sotto di un valore di assorbimento di 1 durante le misurazioni.

È da notare che l'assorbanza è inversamente proporzionale a ciò che è noto come trasmittanza (consulta un libro di testo per i dettagli); a un valore di assorbanza di 1, il 10% della luce viene trasmessa attraverso il campione; a 2, l'1% della luce viene trasmessa, e così via secondo un andamento logaritmico.

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La spettrofotometria