Curva standard

L'efficienza della reazione PCR è molto importante per la corretta interpretazione dei risultati qPCR. Dipende dal dosaggio, dalle prestazioni della miscela master e dalla qualità del campione. Viene calcolata sulla base di una curva standard.

Una curva standard è fatta da diverse reazioni qPCR, su una serie di diluizioni 10X di DNA. La serie di diluizione può essere fatta da un pool di campioni di cDNA che si intende testare, diluiti successivamente 10 volte. Per costruire una curva standard è necessario tracciare i valori Ct ottenuti per ogni diluizione (parte superiore della figura sottostante) contro il logaritmo dei fattori di diluizione (DF) utilizzati per realizzare la curva standard. La curva standard è quindi la linea di regressione attraverso questi punti (parte inferiore della figura qui sotto, lato sinistro). La pendenza della linea di regressione è correlata all'efficienza di amplificazione dalla formula nella figura sottostante. Generalmente, l'efficienza tra l'80 e il 110% è considerata accettabile. Al 100% stai raddoppiando la quantità di prodotto in ogni ciclo della tua reazione PCR. Puoi anche usare la linea di regressione per determinare la concentrazione di campioni sconosciuti dai loro valori Ct.