Analisi qPCR

I risultati della qPCR consistono in una curva di fusione e un grafico di amplificazione.

• La curva di fusione mostra a quale temperatura i filamenti di DNA si fondono/separano. Questo è molto utile per valutare se stai misurando solo l'amplificazione del tuo trascritto o se hai dei contaminanti.

• Il grafico di amplificazione mostra il cambiamento di fluorescenza come log (ΔRn) in ogni ciclo di PCR.

Il ciclo in cui la fluorescenza attraversa una determinata soglia è chiamato valore Ct (chiamato anche Cq per ciclo di quantificazione). Un Ct basso indica un'alta quantità di trascrizione iniziale, poiché sono stati necessari solo pochi cicli per raggiungere la soglia di fluorescenza, e quindi un'alta espressione del gene studiato. Un valore Ct alto indicherà piccole quantità di trascrizione iniziale, in quanto è stata necessaria un'elevata quantità di cicli di amplificazione per raggiungere la soglia di fluorescenza, e quindi una bassa espressione del gene.

All'inizio, si dovrebbe verificare se i controlli negativi hanno prodotto un segnale. Se c'è un segnale per questi controlli dell'acqua, l'esperimento è contaminato da DNA estraneo e i risultati non sono validi.

Ci sono diversi metodi per calcolare le quantità relative di ogni DNA dalla fluorescenza misurata. Il metodo più comune è il metodo delta delta Ct.