Trasformazione (tecnica biotecnologica)

La trasformazione è un'importante tecnica utilizzata per inserire del DNA esogeno all'interno di una cellula ospite. Una delle numerose tecniche di trasformazione è l'elettroporazione. Si tratta di un metodo di trasformazione meccanica che utilizza un impulso elettrico per aprire temporaneamente dei pori nella membrana cellulare. I pori permettono alle molecole di DNA di penetrare la membrana cellulare ed entrare all'interno della cellula. L'elevata tensione elettrica causa la formazione di pori idrofobici di circa 2 nm al livello della membrana cellulare.

Parametri dell'elettroporazione

• Tensione elettrica

La condizione elettrica per l'elettroporazione varia per ogni microrganismo. Ad esempio, il lievito, come il Saccharomyces cerevisiae, ha uno stato elettrico ottimale di 40μL, 1,5 kV per circa 5 ms.

• Cellula

Cellule elettro-competenti vengono utilizzate per aumentare l'efficienza dell'elettroporazione. La competenza è l'abilità di una cellula di accogliere del DNA "nudo" dal suo ambiente. Le cellule di lievito sono rese elettro-competenti lavandole in una soluzione non ionica per rimuovere tutti i sali, assicurando così che la carica non venga condotta attraverso il terreno di coltura. L'elettroporazione ottimale per il lievito si raggiunge utilizzando del lievito nel terreno di coltura o verso la fine della fase di crescita (fase di crescita esponenziale). La fase di crescita del lievito può essere divisa in tre parti:

• Fase di crescita iniziale: il periodo quando le densità delle cellule sono di circa 10⁷ cellule/mL.
• Fase di crescita intermedia: le colture hanno densità tra 1 e 5 × 10⁷ cellule/mL.
• Fase di crescita finale: avviene quando le densità delle cellule sono tra 5 × 10⁷ e 2 × 10⁸ cellule/mL.

Durante la fase di crescita esponenziale la velocità di crescita è rapida, e la velocità delle divisioni cellulari eccede la velocità della morte delle cellule. Le cellule sono attive metabolicamente ed effettuano replicazioni del genoma sufficienti per una riparazione del DNA efficiente. In tal modo, in questa fase la cellula è in grado di tollerare trattamenti violenti come l'elettroporazione.

• DNA

La frequenza della trasformazione viene aumentata con l'aumento della concentrazione del DNA nel buffer dell'elettroporazione. Ma è importante notare che una concentrazione di DNA eccessiva può anche diminuire l'efficienza della trasformazione. L'esatta concentrazione del DNA deve essere determinata per ciascun esperimento.

• Terreni per l'elettroporazione

Per evitare l'inarcarsi del campione durante l'elettroporazione, è importante lavare accuratamente la cellula elettro-competente per rimuovere i terreni di crescita da essa. Il lavaggio può essere effettuato con acqua o con soluzioni non ioniche come glucosio, glicerolo, saccarosio, sorbitolo o glicole polietilenico. La presenza di materiale ionico può causare inarcamenti durante l'elettroporazione.

Di preferenza, viene utilizzato il sorbitolo, in quanto agisce come crioprotettore non permeante, riducendo significativamente i danni alla membrana cellulare durante lo scongelamento. I danni alla membrana riducono significativamente l'efficienza della trasformazione.

Durante la procedure di elettroporazione, la temperatura aumenta e le cellule vengono danneggiate a causa del rapido afflusso ed efflusso di acqua dovuto al disequilibrio osmotico extracellulare e intracellulare. Questo tipo di danno può essere evitato grazie a uno stabilizzatore osmotico come il sorbitolo. In tal modo, il sorbitolo agisce come crioprotettore e osmoregolatore.

Spatolamento

Lo spatolamento si riferisce a un metodo di distribuzione uniforme dei batteri sulla superficie di una piastra di agar. Sulla superficie della piastra di agar viene diffuso uniformemente con una spatola di vetro un piccolo volume di coltura microbica. Procedura dello spatolamento:

• La spatola di vetro andrebbe sterilizzata col calore della fiamma del becco Bunsen. Innanzitutto, immergere la spatola di vetro in alcol (etanolo 70%), scrollare l'alcol in eccesso, e riscaldare sul fuoco il residuo. Infine, lasciar raffreddare la spatola.
• Distribuire la coltura microbica uniformemente sulla superficie del terreno di coltura. La pressione viene applicata uniformemente mentre la spatola distribuisce la coltura sulla superficie della piastra.
• Lasciare che la coltura microbica venga assorbita dal terreno di coltura.
• Incubare la piastra capovolta per evitare che goccioline di acqua di condensa si formino sulla piastra.

È importante scegliere una singola colonia per isolare i cloni genetici puri. Una colonia è un gruppo di cellule originato dalla stessa fonte; quindi, tutte le cellule di una singola colonia contengono informazioni genetiche identiche.

Selezione dell'antibiotico

Il terreno di coltura utilizzato nella clonazione molecolare è un terreno ricco che promuove la crescita microbica. I terreni selettivi possono essere utilizzati per evitare confusione nella scelta tra colonie trasformate e colonie non trasformate. Un terreno selettivo viene preparato aggiungendo antibiotici come ampicillina, igromicina, zeocina-bleomicina e kanamicina. L'antibiotico utilizzato deve corrispondere al gene di resistenza agli antibiotici codificato in un vettore plasmidico: vale a dire, se un vettore plasmidico contiene il gene β-lattamasi (gene di resistenza all'ampicillina), allora l'ampicillina deve essere utilizzata come agente selettivo.

I microbi che sono stati trasformati conterranno il particolare gene di resistenza agli antibiotici codificato nel vettore plasmidico. Il gene della resistenza agli antibiotici consente di selezionare le colonie trasformate tra quelle non trasformate. Poiché le colonie trasformate esprimono determinate proteine necessarie per resistere all'effetto antibiotico, esse possono sopravvivere nei terreni contenenti antibiotico, dove le colonie non trasformate non possono.

L'efficacia di un particolare sistema di resistenza agli antibiotici è determinata da:

• L'agente selettivo (antibiotico).

Dovrebbe inibire completamente la crescita non trasformata.

• Gene di resistenza.

Dovrebbe esprimere la proteina necessaria per resistere completamente all'effetto dell'agente selettivo. Il livello di espressione genica resistente può essere controllato da segnali di controllo trascrizionali e traslazionali abituati a esso.

• Il materiale da selezionare.

In questo caso, il materiale da selezionare sono le cellule microbiche. Le cellule microbiche dovrebbero essere sensibili all'effetto antibiotico.

L'ampicillina è comunemente usata per la selezione batterica. Tuttavia, il lievito non è sensibile all'ampicillina; quindi, non può essere utilizzato come agente selettivo per lo screening della trasformazione del lievito. Uno dei tanti antibiotici che possono essere utilizzati nello screening della trasformazione del lievito è lo zeocin. Lo zeocin fa parte degli antibiotici di tipo bleomicina/fleomicina isolati dagli Streptomyces. Lo zeocin provoca la morte cellulare legando e scindendo il DNA all'interno della cellula. Il gene Sh ble (Streptoalloteichus) codifica la proteina di resistenza zeocin hindustanus bleomicina. Questa proteina si legherà allo zeocin in modo stechiometrico causando l'inibizione dell'attività di scissione del filamento di DNA dello zeocin.