Estrazione mediante fenolo-cloroformio-tiocianato di guanidinio

Un metodo comunemente usato per isolare l'RNA totale è l'estrazione mediante fenolo-cloroformio-tiocianato di guanidinio. Questo metodo utilizza una sostanza chimica chiamata TRIzol, che contiene isotiocianato di guanidinio, un potente denaturante delle proteine, e fenolo, un solvente organico. Il TRIzol mantiene l'integrità dell'RNA, distrugge le cellule e denatura le proteine. Questo metodo è basato sulle ricerche di Piotr Chomczynski e Nicoletta Sacchi nel 1987 e 2006. Richiede tempistiche superiori rispetto ai metodi basati su colonne come RNAeasy (Qiagen), ma può gestire quantità maggiori di tessuto o cellule e quindi produce più RNA.

Le fasi principali dell'isolamento dell'RNA sono le seguenti:.

• lisi cellulare e rottura delle strutture cellulari;
• separazione dell'RNA dai detriti cellulari;
• purificazione dell'RNA dal DNA e dalle proteine;
• precipitazione dell'RNA;
• lavaggio e risospensione dell'RNA.

Il lisato è costituito da RNA, DNA, proteine e detriti cellulari. La centrifugazione può essere usata per separare le macromolecole (proteine, RNA e DNA) dai detriti cellulari. La separazione di fase del campione avverrà quando il cloroformio viene aggiunto al campione, in base alle diverse densità. Inoltre, il pH determinerà la separazione degli acidi nucleici e delle proteine. L'RNA polare rimarrà nella fase polare superiore, il DNA si accumulerà nell'interfase e le proteine denaturate si discioglieranno nella fase organica inferiore.

L'RNA della fase acquosa viene precipitato aggiungendo isopropanolo, che precipita le molecole polari come gli RNA e i sali. I sali possono essere lavati via con etanolo al 75% per ottenere RNA puro. Infine il pellet di RNA viene asciugato e risospeso usando acqua priva di RNasi come tampone.

Dopo l'isolamento dell'RNA vengono valutate la concentrazione e purezza dell'RNA stesso. Anche la sua qualità deve essere verificata prima di condurre ulteriori analisi.