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Inibizione non competitiva

Un inibitore non competitivo interagisce con il complesso enzima-substrato, ma non con l'enzima da solo. Per l'inibizione non competitiva, l'equazione di doppia reciprocità è la seguente:

1/V0 = α’/Vmax + Km/Vmax • 1/[S]

dove α’ = 1+[I]/K’I

Questa equazione mostra che un grafico a doppia reciprocità dei dati cinetici dell'enzima con concentrazioni variabili di un inibitore non competitivo dovrebbe dare una linea retta con intercette y variabili, ma con le stesse pendenze (Figura 1). Nei saggi di cinetica enzimatica con un inibitore non competitivo, la Km apparente e la Vmax cambieranno con l'aumentare delle concentrazioni dell'inibitore [1].

A sinistra, un grafico Lineweaver-Burk con 1 diviso per V sull'asse y e 1 diviso per la concentrazione del substrato sull'asse x. Il grafico mostra l'inibizione non competitiva come tre linee diverse di colore verde, blu e rosso. Queste linee rappresentano diverse trame con diverse concentrazioni di inibitore non competitivo e le linee hanno le stesse pendenze. Tuttavia, le tre linee si intersecano in punti diversi dell'asse y. La linea verde si interseca con l'asse y ad un valore più alto rispetto alle altre due linee. La linea blu si interseca ad un valore più basso sull'asse y rispetto alla linea verde; tuttavia, la sua intersezione con l'asse y è più alta della linea rossa, che è la linea con l'intersezione y più bassa. A destra c'è un altro grafico che mostra le intersezioni y di ogni regressione lineare tracciata in rapporto alla concentrazione dell'inibitore. Il grafico mostra che all'aumentare della concentrazione dell'inibitore, aumentano anche gli intersezioni y della linea di regressione lineare

Figura 1: a) Grafico Lineweaver-Burk che mostra l'inibizione non competitiva. b) intercette y di ogni regressione lineare tracciate in rapporto alla concentrazione dell'inibitore.

Calcolare K’I, Km e Vmax

Quando si lavora con un inibitore non competitivo, nessun parametro può essere calcolato dai grafici iniziali Lineweaver-Burk. Per calcolare i diversi parametri, le "intercette y" di questi grafici devono essere tracciate in rapporto alla concentrazione dell'inibitore:

intercetta ynon competitivo = α’/Vmax = 1/Vmax + 1/Vmax • 1/KI • [I]

Questo grafico dovrebbe, quindi, risultare in una linea retta con l'intercetta 1/max e la pendenza 1 / (Vmax • KI ). KI può quindi essere calcolato dividendo la pendenza di questa linea retta con l’intercetta. Anche Vmax può essere calcolato da questo adattamento, prendendo il reciproco dell'intercetta y. Poiché le trame iniziali di Lineweaver-Burk avevano le stesse pendenze, Km / Vmax, Km possono ora essere calcolati moltiplicando queste pendenze con Vmax, ottenuto dalla trama delle intercette y in rapporto alle concentrazioni di inibitore.

Fasi di calcolo dei parametri cinetici quando si usa un inibitore non competitivo

  • Prepara i grafici Lineweaver-Burk dei dati cinetici e adatta i dati usando la regressione lineare (1 adattamento per concentrazione di inibitore).

  • Traccia le intercette y di ciascuno di questi adattamenti in funzione della concentrazione dell'inibitore.

  • Per calcolare Vmax, prendi il reciproco dell'intercetta y di questo grafico.

  • Per calcolare KI, dividi l'intercetta y di questo grafico con la pendenza.

  • Per calcolare Km, torna ai primi grafici Lineweaver-Burk, prendi la pendenza da 1 di questi grafici (la pendenza dovrebbe essere la stessa, o vicina, per tutti i grafici), e moltiplicala per Vmax.

Fonti

  1. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2008). Principles of Biochemistry (5th ed.). New York, NY: W.H. Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-7108-1.

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