Il rilevamento delle proteine tramite anticorpi

La rilevazione della proteina di interesse è possibile grazie all'uso di anticorpi specifici. Prima che gli anticorpi vengano applicati alla membrana, viene aggiunta una soluzione bloccante, in genere la sieroalbumina bovina 5% (BSA) o il latte disidratato privo di grassi (NFDM), per prevenire il legame non specifico delle proteine.

Generalmente, nei Western blot vengono usati due anticorpi: gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari. Gli anticorpi primari hanno un unico sito di legame in grado di riconoscere proteine specifiche. Dopo che la membrana è stata incubata con gli anticorpi primari e gli anticorpi primari non legati vengono lavati via, vengono aggiunti gli anticorpi secondari. Gli anticorpi secondari si legano selettivamente agli anticorpi primari e servono non solo come portatori dell'etichetta di rilevamento, ma anche come amplificatori del segnale emesso. L'etichetta legata agli anticorpi secondari è solitamente una biotina o un enzima messaggero come la fosfatasi alcalina (AP) o la perossidasi di rafano (HRP).

Figura 1. Rilevazione delle proteine tramite anticorpi.

È disponibile un'ampia gamma di anticorpi secondari con diversi sistemi di marcatura divisa in quattro sistemi di rilevamento: colorimetrico, a chemiluminescenza, radioattivo e fluorescente.

Come per tutti gli esperimenti, è importante aggiungere un controllo sperimentale. Nel Western blot, questo serve a verificare se è stata aggiunta una quantità simile di campione e quindi a garantire che i risultati possano essere confrontati. Il controllo più comune è l'actina. Questa proteina è espressa ad alti livelli in tutte le cellule e può essere visualizzata in modo affidabile su un Western blot.