La preparazione del campione per il Western blot

Ci sono metodi differenti per preparare il campione a seconda che una proteina sia extracellulare o intracellulare. Le proteine intracellulari sono più difficili da estrarre, e la relativa procedura deve essere eseguita con molta attenzione.

Figura 1. Preparazione del campione per il Western blot.

La composizione cellulare di ogni organismo è data da una complessa miscela di molecole tra cui proteine, acidi nucleici, polisaccaridi e sali. Queste molecole possono interferire con il metodo del Western blot; da qui l'importanza della preparazione del campione. Esistono numerosi metodi per dissolvere le cellule e preparare il campione per il Western blot. In genere, quando si ha a che fare con cellule di mammiferi, è possibile rimuovere la membrana cellulare mediante lisi con detergenti, lisi di congelamento/disgelo o omogeneizzazione e sonicazione meccanica.

Dopo l'estrazione, il campione di proteine viene fatto bollire in una soluzione contenente un colorante tracciante (blu di bromofenolo), un agente riducente che rompe i legami disolfuro (beta-mercaptoetanolo) e un detergente (sodio dodecil solfato/SDS). L'ebollizione denatura le proteine, che quindi si dispiegano. Il beta-mercaptoetanolo impedisce che i legami disolfuro si riformino e provoca quindi la rottura della struttura quaternaria e terziaria delle proteine, creando polipeptidi a catena lineare. Il sodio dodecil solfato conferisce alle proteine carica negativa.