Western blot: risoluzione dei problemi

Bolle d'aria

Eventuali bolle d'aria sono causate da un posizionamento non accurato del gel e della membrana sul sandwich o da una mancata rimozione delle bolle d'aria con un rullo o una tessera di plastica. Le bolle d'aria creano sacche dove non c'è buffer e quindi conducibilità elettrica. In queste aree, il campione non viene trasferito dal gel alla membrana e quest'ultima presenterà piccole macchie bianche ben definite quando viene colorata con il colorante Ponceau S.

Scarsa conducibilità

Poiché l'elettricità è condotta dagli ioni nel buffer, un ammollo insufficiente può portare ad aree di scarsa conducibilità. Queste aree tendono a essere più grandi e meno definite di quelle causate dalle bolle d'aria.

Surriscaldamento

L'esperimento può surriscaldarsi se c'è un aumento della resistenza dovuto a una conducibilità molto scarsa o a una mancanza di raffreddamento. Il primo caso è causato da un insufficiente ammollo con il buffer, il secondo dalla mancata aggiunta di una mattonella di ghiaccio durante il trasferimento. Questo può portare alla bruciatura della membrana o allo scioglimento del gel. Nelle aree in cui il gel si è sciolto non avverrà alcun trasferimento di proteine; queste aree risulteranno vuote quando la membrana viene colorata con il Ponceau S.

Direzione di migrazione errata

Le proteine migrano dal catodo all'anodo. Il gel deve quindi essere rivolto verso l'anodo e la membrana verso il catodo. Se il sandwich è assemblato nell'ordine sbagliato o la cassetta è inserita nell'apparato nel verso errato, le proteine potrebbero trasferirsi nella direzione della carta assorbente invece che in quella della membrana. Quando viene colorata con il Ponceau S, la membrana apparirà vuota.

Strati non allineati

Se gli strati non sono allineati correttamente o non sono sufficientemente compatti, possono muoversi durante l'esperimento. Questo risulterà in bande meno definite sulla membrana a seguito della colorazione con il Ponceau S.

Orientamento sbagliato

Le proteine sono caricate sul gel SDS-PAGE in un certo ordine. Se il gel viene ruotato o capovolto durante la fase di trasferimento, si rischia di confondere i campioni. Per evitare questa evenienza, il gel non deve essere simmetrico. L'asimmetria può essere ottenuta tagliando un angolo del gel e contrassegnando la membrana con una penna.