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Le Master Mix

Pour une expérience avec 7 tubes d’échantillon et 5 réactifs (dont 4 ayant la même concentration), le nombre de mouvements de pipette nécessaires est indiqué. La figure ci-dessous montre le nombre de mouvements de pipette nécessaires sans recours à un Master Mix. Pour la même expérience, on se sert à présent du Master Mix. Notez la baisse du nombre de mouvements de pipettes - imaginez des expériences encore plus importantes et la différence de temps et de charge de travail obtenue.

Une illustration du nombre total de mouvements de pipettes nécessaires au cours d'une expérience avec et sans recours à un Master Mix. 7 tubes d’échantillons vides et 5 tubes d’échantillons contenant différents réactifs sont représentés. Les réactifs sont illustrés en différentes couleurs. De gauche à droite, les réactifs sont colorés en jaune, rouge, vert et bleu. Un cinquième tube d’échantillon contenant également un réactif est marqué de la couleur grise. Des lignes colorées, correspondant à la couleur de chaque réactif, vont des tubes de réactif aux tubes d’échantillon vides, illustrant comment chaque réactif est ajouté à chaque tube d’échantillon. Les réactifs jaune, rouge, vert et bleu sont tous ajoutés à la même concentration. Le réactif gris est ajouté à des concentrations différentes dans chacun des tubes d’échantillon vides. Chaque ligne peut être comptée comme un mouvement de pipette et le nombre total de mouvements de pipette requis pour l’expérience sans mélange maître est de 35. Sous l’illustration se trouve une autre illustration du même montage expérimental, mais dans ce cas avec l’utilisation d’un mélange maître. Un autre tube d’échantillon contenant le mélange maître, représenté en bleu, est ajouté au montage et les lignes colorées des 4 tubes de réactifs représentés en jaune, rouge, vert et bleu, mènent maintenant des tubes de réactifs au tube de mélange maître, ce qui réduit le nombre de mouvements de pipette. D’autres lignes, illustrant également les mouvements de la pipette, vont maintenant du tube de mélange maître et du tube de réactif gris vers les 7 tubes d’échantillon vides. Tous les mouvements de pipette, des réactifs au Master Mix et du Master Mix aux tubes vides, conduisent à un nombre considérablement plus faible de mouvements de pipette requis, qui n’est plus que de 18

Figure 1 : Deux dispositifs expérimentaux avec 7 tubes d’échantillon et 5 réactifs (dont 4 ayant la même concentration). Le nombre de mouvements de pipettes nécessaires est indiqué. Cette figure montre le nombre de mouvements de pipette nécessaires avec et sans l’utilisation d’un Master Mix.

Lorsqu’on réalise une expérience avec un grand nombre d’échantillons similaires, il est courant de préparer un Master Mix pour réduire la charge de travail dans le laboratoire. Si tous vos échantillons ont un mélange similaire de réactifs, avec seulement un réactif variant d’un échantillon à l’autre, un Master Mix peut être préparé avec tous les réactifs communs (bien sûr, ceci n’est possible que si tous les réactifs sont requis dans les mêmes concentrations). Maintenant, lorsque vous préparez vos échantillons, vous pouvez pipeter à partir du mélange maître et ensuite ajouter votre réactif variable, au lieu de mélanger, par exemple, 4 réactifs différents en quantités correctes dans chaque tube. Ce concept est illustré dans la figure ci-dessus.

Dans ce cas de cinétique enzymatique, à une concentration spécifique de substrat, un Master Mix, contenant du NAD+, de l'éthanol et un tampon, peut être préparé. Lorsque l'enzyme est ajoutée, la réaction commence et l’enzyme n’est donc pas incluse dans le Master Mix. Il ne s’agit pas d’un cas où il est crucial d’utiliser un Master Mix ; cependant, cette compétence est essentielle pour de nombreuses applications, et elle est très utile dans les essais de cinétique enzymatique en général.

Le calcul des concentrations de substrat

Au cours de l’expérience, vous devrez calculer la quantité de substrat à ajouter dans un tube pour obtenir la concentration de substrat souhaitée. Pour ce faire, vous pouvez utiliser la formule suivante :

C1 · V1 = C2 · V2

Où C = concentration et V = volume. N’oubliez pas d’utiliser les mêmes unités des deux côtés du signe d’égalité !

**Exemple : nous disposons d’une solution mère de substrat à 1 m, et nous avons besoin d’une concentration finale de 200 mm dans un volume de 500 µl ; quel est le volume de solution mère que nous devons ajouter pour atteindre la concentration souhaitée ?

Si la concentration de base est C1, C2 sera la concentration finale souhaitée et V2 sera le volume final. Cela fait de V1 l’élément inconnu. Nous pouvons maintenant isoler V1, insérer les valeurs connues et calculer le volume :

Isoler : V1 = (C2 · V2)/C1

Insérer et calculer : V1 = (0,2 M · 0,0005 l) / 1 M = 0,0001 L = 100 μl