Les réactifs utilisés dans la coloration de Gram

Pour la coloration de Gram, on a recours à quatre réactifs.

1. Le violet de gentiane ou cristal violet (CV) est la coloration primaire et sert à colorer les bactéries à Gram positif et à Gram négatif en violet ou en rose, respectivement. Les molécules de cristal violet sont chargées positivement et se lient aux structures de la paroi cellulaire des bactéries, chargées négativement.

2. L’iode (I) agit comme fixateur de colorant (mordant) pour fixer la coloration violette aux bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Les molécules d’iode se lient aux molécules du violet de gentiane via des forces électrostatiques et forment ainsi un grand complexe violet de gentiane-iode insoluble (le complexe VG-I).

3. L’alcool éthylique à 95 % (l’éthanol) sert à décolorer les bactéries à Gram négatif. L’alcool dissout la membrane extérieure et perturbe la couche de peptidoglycane fine, ce qui permet aux complexes VG-I violets de traverser la paroi cellulaire de la bactérie à Gram négatif. Les bactéries à Gram positif restent violettes après la décoloration à l’alcool, puisque leur couche de peptidoglycane épaisse et solide peut résister à l’alcool et conserver les complexes VG-I.

4. La safranine sert à recolorer les bactéries à Gram négatif en rose. Comme avec le violet de gentiane, la molécule de safranine est chargée positivement et se lie aux structures de la paroi cellulaire des bactéries, chargées négativement. Les bactéries à Gram positif sont déjà colorées en violet grâce au violet de gentiane plus sombre et le resteront, même après l’ajout de la safranine rose.

Figure 1 : Schéma descriptif de la méthode de coloration de Gram