Labster Logo

Le spectrophotomètre

Un spectrophotomètre est un instrument qui donne des informations sur l’intensité de l’énergie rayonnée. Il mesure le rapport entre l’intensité de la lumière émise par une source interne et celle qui traverse une solution donnée. Ce rapport peut servir à déterminer la concentration des molécules dissoutes dans un échantillon.

Pour mesurer un échantillon, le spectrophotomètre est réglé au préalable pour mesurer à une certaine longueur d’onde. La longueur d’onde détectée peut être ajustée sur une valeur optimale pour mesurer un composé spécifique.

Le spectrophotomètre transmet les données mesurées sous forme de valeurs d’absorbance (A). On se sert de la formule log(I0/It) pour calculer l’absorbance. I0 est l’intensité de la lumière incidente (qui atteint l’échantillon) et It l’intensité de la lumière qui traverse la solution et atteint un détecteur photovoltaïque.

Il existe une relation linéaire entre l’absorbance et la concentration qui est décrite par la loi de Beer-Lambert :

A = εcl

où c est la concentration de la solution, l la longueur du trajet, autrement dit la distance parcourue par la lumière lorsqu’elle traverse une solution (généralement la largeur d’une cuvette), et ε le coefficient d’extinction spécifique à un composé.

Une illustration des composants d’un spectrophotomètre. De gauche à droite, la lumière est émise par une source lumineuse, les flèches représentant le trajet de la lumière. Les flèches pointent vers la droite en direction d’un collimateur représenté par une lentille ovale que la lumière traverse. Puis les flèches pointent à nouveau vers la droite et la lumière traverse un monochromateur en forme de prisme. À partir du monochromateur, la lumière est étalée dans un champ plus large qui met en valeur toutes les longueurs d’onde représentées dans différentes couleurs. La lumière atteint un sélecteur de longueur d’onde ou une fente et seule une longueur d’onde spécifique représentée par une ligne de lumière jaune peut passer au travers. Ensuite, la ligne jaune traverse une cuvette cylindrique remplie d’une solution échantillon. Sur le côté gauche de la cuvette se trouve I 0 et sur le côté droit se trouve I t. À l’extrémité du spectrophotomètre se trouve une cellule photoélectrique ou un détecteur qui mesure l’intensité de la lumière qui traverse la cuvette et les résultats sont affichés sur un écran numérique, également appelé compteur

Figure 1 : Les composants d’un spectrophotomètre : La lumière émise par la source traverse la fente, ne laissant passer qu’une longueur d’onde spécifique. Cette lumière traverse en partie l’échantillon qui se trouve dans une cuvette et le détecteur mesure l’intensité de l’autre côté de la cuvette.

À titre d’exemple, nous allons mesurer les concentrations de NADH (nicotinamide adénine dinucléotide). Le NADH a un maximum d’absorption de 340 nm. Le spectrophotomètre est alors réglé pour mesurer à cette longueur d’onde. Le coefficient d’extinction du NADH, ε est égal à 6220 M-1cm-1. La longueur du trajet est la largeur de la cuvette, soit 1 cm.

La loi de Beer-Lambert présente certaines insuffisances dont les utilisateurs de spectrophotomètres doivent tenir compte. Certaines de ces insuffisances sont d’ordres techniques. Cependant, la principale insuffisance de cette loi, c’est qu’elle ne s’applique qu’aux solutions diluées. Lorsque la concentration d’une espèce absorbante augmente, la fréquence des interactions physico-chimiques entre molécules augmente également. Par conséquent, à une concentration donnée, les molécules commencent à avoir une incidence sur la répartition des charges des molécules environnantes. La relation entre l’absorbance et la concentration n’est alors plus linéaire. En règle générale, il faut rester en dessous d’une valeur d’absorption de 1 pour les mesures.

L’absorbance est inversement proportionnelle à la transmittance (la lumière qui traverse un échantillon, mais qui n’est pas absorbée). Lorsque l’absorbance = 1, 10 % de la lumière est transmise à travers l’échantillon. Lorsqu’elle est égale à 2, 1 % de la lumière est transmise, et ainsi de suite suivant une constante logarithmique.