Análisis de la PCR cuantitativa

El resultado de la PCR cuantitativa es una curva de fusión y un gráfico de amplificación.

• La curva de fusión muestra a qué temperatura se funden o se separan las cadenas de ADN. Si estás midiendo solo la amplificación de tu transcripción o tienes contaminantes, evaluar este factor es muy útil.

• El gráfico de amplificación muestra el la variación de fluorescencia como log (ΔRn) en cada ciclo de PCR.

El ciclo en el que la fluorescencia supera el umbral se llama valor de Ct (o también Cq, 'ciclo de cuantificación'). Un Ct bajo indica que partimos de una gran cantidad de transcripciones, ya que en solo unos pocos ciclos alcanzamos el umbral de fluorescencia y, por tanto, que el gen investigado tiene una expresión muy alta. Un valor Ct alto indica que partimos de pocas transcripciones, ya que habremos necesitado muchos ciclos para alcanzar el umbral de fluorescencia y, por tanto, que el gen investigado tiene una expresión muy baja.

En primer lugar, se debe comprobar si los controles negativos han producido alguna señal. Si hay señal en estos controles de agua, el experimento está contaminado con ADN externo y los resultados no son válidos.

Hay distintos métodos para calcular las cantidades relativas de cada ADN a partir de la fluorescencia medida. El método más común es el método delta delta Ct.