Detección de proteínas utilizando anticuerpos

La detección de la proteína de interés es posible gracias al uso de anticuerpos específicos. Antes de aplicar anticuerpos a la membrana, se añade una solución de bloqueo, normalmente albúmina de suero bovino al 5 % (ASB) o leche en polvo desnatada, para evitar la unión de proteínas no específicas.

Por lo general, en el Western blot se utilizan dos tipos de anticuerpos: primarios y secundarios. Los anticuerpos primarios tienen un sitio de unión único que reconoce proteínas específicas. Después de incubar la membrana con los anticuerpos primarios y eliminar mediante lavado los que no se han unido, se añaden los anticuerpos secundarios, que se unirán de forma selectiva a los anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios no solo sirven para transportar el marcador de detección, sino también para amplificar la señal emitida. El marcador unido a los anticuerpos secundarios suele ser una biotina o una enzima reportera, como la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PHR).

Figura 1: Detección de proteínas mediante la utilización de anticuerpos.

Existe una amplia variedad de anticuerpos secundarios con distintos sistemas de identificación en cuatro sistemas de detección: colorimétrico, por quimioluminiscencia, radioactivo y fluorescente.

Como en todos los experimentos, es importante añadir un control experimental. En el Western blot, este sirve para comprobar que se ha añadido una cantidad similar de muestra y asegurarse de que los resultados son comparables. El control más común es la actina. Esta proteína se expresa en niveles altos en todas las células y puede visualizarse de manera fiable en un Western blot.